丝素蛋白-左旋聚乳酸微载體扩增脂肪来源干细胞的实验研究
黄元亮，穆琳，林燕娴，蒋海越，滕利中國医學科學院整形外科病院颅颌面中間（北京100144））
基金項目：中國医學科學院医學與康健科技立异工程（2017-I2M-1-007）
关头词：丝素卵白-左旋聚乳酸；微载體；動态培育；脂肪来历干细胞
援用本文：黄元亮, 穆琳, 林燕娴, 等. 丝素卵白-左旋聚乳酸微载體扩增脂肪来历干细胞的实行钻研. 中國修复重修外科杂志, 2021, 35(5): 611-619. doi: 10.7507/1002-1892.202101048
摘 要
線上看a片,目标 探究丝素卵白-左旋聚乳酸（silk fibroin-poly-L-lactic acid，SF-PLLA）微载體對脂肪来历干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的扩增感化及對其分解能力的影响。
法子 利用脂肪抽吸術患者志愿捐赠脂肪组织，經酶消化法提取 ADSCs。取第 3 代 ADSCs 别离接种于 CultiSpher G 和 SF-PLLA 微载體（别离设為 A、 B 组），细胞-微载體复合物利用扭转生物反响器培育，并采纳正常二维平面傳代培育的 ADSCs 作為比照组（C组）。利用扫描電镜察看两种微载體布局及细胞發展状态；Live/Dead 染色察看细胞在两种微载體上散布及成活环境；DNA 定量法检测两种微载體上细胞增殖环境；培育 18 d 及時荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测 3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂相干基因表达，行流式细胞術判定 MSCs 概况标记物，并行成软骨、成骨、成脂三系分解判定。
成果 ADSCs 在两种微载體上都可黏附并实現高效扩增，扩增18 d 時两种微载體上 ADSCs 总扩增量差别无统计學意义（P>0.05）。對扩增所得 ADSCs 行 qRT-PCR 检测示，與 C组比力，B 構成软骨相干基因（卵白聚糖、软骨寡聚基质卵白、软骨特异性基因 SOX9）呈显著上调，A 構成脂相干基因（過氧化物酶體增殖物激活受體 γ、脂卵白酯酶、脂联素基因）呈显著上调，差别均有统计學意义（P<0.05）。流式细胞術检测與三系分解判定显示两种微载體扩增後细胞仍為 ADSCs，仍具备三系分解能力。
结論 SF-PLLA微载體可用于扩增 ADSCs，且扩增所得细胞成软骨分解趋向显著提高，成脂分解趋向低落。
正 文
MSCs 具备多向分解潜能，在组织工程及再生医學中具备杰出的利用远景。但从人體直接得到的 MSCs 有限，為了到达利用需求，常需举行體外扩增。傳统细胞扩增凡是借助于培育瓶或培育皿在二维平面前提下举行傳代培育，该法培育基操纵率低，而且必要反复傳代及改换培育基等操作，增长了耗材、劳動本錢與污染危害。别的，该法没法摹拟 MSCs 在生物機體内繁杂的微情况，持久傳代培育的 MSCs 表示出增殖能力降低，并逐步落空多向分解潜能。基于多孔微载體三维動态培育的 MSCs 扩增计谋，是将细胞接种于微载體上，举行搅拌悬浮@培%9ZFNh%育或摹%d7t31%拟@微重力體系培育，不但加倍切近细胞在體内的微情况，并且因為微载體供给了大量供细胞發展贴附的概况面积，从而使空間及培育基操纵率更大，更@合%55p5B%适大范%4ax74%畴@扩增细胞。
微载體可分為可降解型與不成降解型，不成降解型如 Cytodex 系列微载體，扩增後需将所得细胞消化收成，该步调常丧失很大比例细胞。比拟而言，可降解型如 CultiSpher 系列微载體，可不經消化采集细胞，直接用于组织工程移植，大大提高了细胞操纵率。咱们前期钻研發明，左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）微载體在软骨细胞扩增和保持软骨细胞表型方面均优于 CultiSpher G 微载體。但是，零丁利用 PLLA 作為微载體质料细胞亲和力不敷，细胞贴附欠安。故在此根本上，咱们改良了微载體质料，将 PLLA 微载體被覆丝素卵白（silk fibroin，SF）。脂肪来历干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具备来历充沛、易获得、有多向分解能力等长处，是组织工程很是有远景的一类 MSCs。本钻研采纳 SF-PLLA 微载體扩增ADSCs，以期摸索一种加倍合适 ADSCs 增殖并用于软骨组织工程的可降解型微载體。
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临 床 資 料
.1 重要质料、试剂及仪器
人脂肪组织取自中國医學科學院整形外科病院行雙下肢脂肪抽吸術的康健女性，样本获得均經患者知情赞成。
L-DMEM 培育基、FBS、青/链霉素、胰卵白酶-0.25%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型胶原高雄當舖, 酶（Sigma 公司，美國）；成骨培育基、成软骨培育基、成脂培育基（Cyagen 公司，美國）；PicoGreenTM dsDNA 定量检测试剂盒、Live/DeadTM 细胞活气检测试剂盒（Thermo 公司，美國）；RNA 提取试剂盒（Qiagen 公司，德國）；逆转录试剂盒（北京全式金生物技能有限公司）；人 MSCs 流式检测试剂盒（BD 公司，美國）；CultiSpher G 微载體（Percell Biolytica 公司，瑞典）；SF-PLLA 微载體（中國医學科學院生物工程钻研所）。
CO2 培育箱（Thermo 公司，美國）；扭转生物反响器（rotary cell culture system，RCCS；Synthecon公司，美國）；颠倒显微镜（Olympus 公司，日本）；共聚焦荧鲜明微镜（Leica 公司，德國）；流式细胞仪（BD 公司，美國）；LightCycler R 480Ⅱ及時荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）體系（Roche 公司，瑞士）。
1.2 ADSCs 分手、培育和判定
采纳酶消化法获得 ADSCs。详细法子：取 10 mL无菌脂肪组织，PBS 洗涤 2 遍，参加 0.2%Ⅰ型胶原酶，置于 37℃ 恒温摇床震動消化 40 min，参加等體积彻底培育基（含 10%FBS、1% 青/链霉素的 L-DMEM 培育基）终止消化後，300×g 离心 5 min，弃上清。沉淀用 PBS 重悬後，利用 70 μm 细胞筛過滤，滤液以 150×g 离心 5 min，弃上清。适當彻底培育基重悬细胞沉淀，接种于 10 cm 培育皿，于 37℃、 5%CO2 培育箱培育，每 2～3 天换液，待细胞交融90% 後傳代。
取第 3 代 ADSCs 行三系分解判定，包含成骨引诱 21 d 行茜素红染色，成脂引诱 21 d 行油红 O染色，细胞團成软骨引诱 21 d 行阿利新蓝染色；流式细胞仪检测细胞概况标记物（CD11b、CD1九、 CD3四、CD4五、CD7三、CD90、CD10五、HLA-DR）表达。經判定提醒培育後所得细胞為 ADSCs。
1.3 微载體外形察看
取 SF-PLLA 與 CultiSpher G 微载體各 150 mg，用 PBS 浸泡留宿後，高压灭菌；将灭菌後的微载體采纳彻底培育基重悬预处置。取预处置後的微载體置于 24 孔板，采纳颠倒显微镜察看其颗粒外观。
1.4 微载體细胞培育美白牙膏,及相干观测
1.4.1 微载體细胞接种與培育 各取 1 mL 第 3 代ADSCs 悬液（细胞浓度為 2.5×106 個/mL）别离與150 mg 预处置终了的两种微载體充实夹杂，置于50 mL 离心管中，参加彻底培育基至 10 mL，于37℃、5%CO2 培育箱中培育 4 h，每隔 30 min 轻细震動混匀。接种终了後掏出细胞-微载體复合物置于 50 mL 扭转培育皿中，加满彻底培育基；将扭转培育體系置于 37℃、5%CO2 培育箱中，静置留宿後，调解扭转培育體系以 10 r/min 速率起头滚動，培育基每 2～3 天改换 1 次。实行反复 3 次。
1.4.2 扫描電镜察看 取接种前两种微载體和動态培育 18 d 的细胞-微载體复合物，PBS 洗濯 2 次， 2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脱水处置後临界點干燥，真空喷溅铂金离子，扫描電镜察看 ADSCs 在两种微载體概况發展环境。
1.4.3 Live/Dead 染色察看 取動态培育 一、七、1四、 18 d 的两种细胞-微载體复合物，依照试剂盒阐明书法子举行 Live/Dead 染色，室温避光孵育 40 min後，采纳荧光共聚焦显微镜察看细胞在微载體上散布及成活环境。
1.4.4 DNA 定量法检测细胞增殖 取動态培育 一、 四、七、十、1四、18 d 的两种细胞-微载體复合物，PBS洗濯 2 遍；参加 1 mL 0.5 mg/mL 卵白激酶 K，56℃消化留宿；12 000×g 离心 10 min，取 100 μL 上清液参加 100 μL PicoGreen 事情液置入 96 孔板，每一個样品反复 3 孔；避光孵育 5 min，利用酶标仪于 520 nm波利益检测样本吸光度（A）值，經由過程绘制增殖曲线，将 A 值转化為细胞数目。
1.4.5 qRT-PCR 检测成软骨、成骨及成脂相干基因表达 实行分為 3 组：CultiSpher G 微球组（A组）、SF-PLLA 微球组（B 组）與比照组（C 组）。此中 C 组為通例二维平面培育的 ADSCs，详细法子為：初始接种密度為 5 000 個/cm2，待细胞發展至90% 後傳代培育，傳代接种密度與初始接种密度不异。别离取培育 18 d 的两种细胞-微载體复合物及二维平面培育至第 5 代的 ADSCs，按 RNA 提取试剂盒阐明书提取样本 RNA，并按逆转录试剂盒法子，采纳 1 000 ng 系统举行逆转录，将逆转录所得cDNA 举行 qPCR，检测各组细胞成软骨、成骨及成脂相干基因表达。此中成软骨相干基因包含软骨特异性基因 SOX九、Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ， COL2）、软骨寡聚基质卵白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、卵白聚糖（aggrecan， ACAN）、Ⅹ型胶原（collagen type Ⅹ，COL10）；成骨相干基因包含 runt 相干转录因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙卵白（osteocalcin，OCN）、骨粘连卵白（osteonectin， ONN）；成脂相干基因包含過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂卵白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂联素基因（ADIPOQ）。各基因引物序列见表 1。目标基因表达程度利用同同样本 GAPDH 内参基因尺度化，用 2−ΔΔCt 法计较各基因相對于表达量。1.4.6 扩增所得 ADSCs 判定 取各组培育 18 d 所得 ADSCs，采纳流式细胞術检测细胞概况标记物CD11b、CD1九、CD3四、CD4五、CD7三、CD90、 CD10五、HLA-DR 表达；并采纳 1.2 法子举行三系分解判定。
1.5 统计學法子
采纳 SPSS21.0 统计软件举行阐發。数据以均数±尺度差暗示，两组間比力采纳自力样本 t 查验；三组間比力采纳单身分方差阐發，两两比力采纳 SNK 查验；查验水准 α=0.05。
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结 果
2.1 微载體外形察看
颠倒显微镜察看示，两种预处置後的微载體均大致呈球形，CultiSpher G 微载體直径為 130～380 μm，粒径相對于不均一，内部空地较小；SF-PLLA 微载體直径為 100～400 μm，粒径较CultiSpher G 微载體均一，内部布局蓬松，空地较大。见圖 1。
圖 1 两种微载體预处置後外形察看（颠倒显微镜×100） a. CultiSpher G 微载體；b. SF-PLLA 微载體
2.2 微载體细胞培育與相干观测
2.2.1 扫描電镜察看 CultiSpher G 微载體概况粗拙，孔径纷歧，孔隙率较小；而 SF-PLLA 微载體孔隙率大，供细胞發展的空間更大。動态培育 18 d時，两种微载體均连结布局形态不乱，SF-PLLA 微载體上细胞呈球状，细胞舒展水平和细胞間互相毗连不如 CultiSpher G 微载體。见圖 2。
圖 2 扫描電镜察看（×200） 左為 CultiSpher G 微载體，右為 SF-PLLA 微载體 a. 接种细胞前；b. 接种细胞後動态培育18 d
2.2.2 Live/Dead 染色察看 荧光共聚焦显微镜察看示，两种微载體接种细胞後，细胞可顺遂黏附在微载體概况。動态培育 1 d，CultiSpher G 微载體上细胞数目多于 SF-PLLA 微载體。7 d，大量细胞增殖笼盖两种微载體概况，此時微载體之間還没有较着细胞及细胞外基质毗连，且 CultiSpher G 微载體上细胞散布加倍平均，SF-PLLA 微载體上细胞成團散布。14 d，两种微载體概况被覆细胞均进一步增多，并呈現微载體間交融、汇集征象，此中 Cultis-pher G 微载體間细胞毗连布局较清楚、毗连较多。18 d，细胞大量排泄细胞外基质，使得微载體慎密黏附在一块儿，構成集團。CultiSpher G 微载體上细胞形态蔓延，呈多足状贴附于微载體概况，并與其他细胞間構成毗连；而 SF-PLLA 微载體上细胞間毗连相對于较少，细胞更多显現散在成團散布；此時两种微载體概况细胞散布均靠近饱和。见圖 3。
圖 3 動态培育各時候點 Live/Dead 染色察看（荧光共聚焦显微镜×100） 从左至右别离為動态培育 一、七、1四、18 d a. CultiSpher G 微载體；b. SF-PLLA 微载體
2.2.3 DNA 定量法检测细胞增殖 增殖曲线示，细胞接种于两种微载體後，细胞数目均呈逐步增长趋向。此中细胞接种于 CultiSpher G 微载體後可敏捷进入快速增殖期，而 SF-PLLA 微载體上细胞需颠末一段時候顺應後才能到达不异增殖速率。動态培育各時候點 CultiSpher G 微载體上细胞均多于SF-PLLA 微载體，此中 四、七、10 d 時两种微载體上细胞数目比力差别有统计學意义（P<0.05）。10瑪卡保健食品, d時，两种微载體上细胞發展均起头缓解，18 d 時两种微载體上细胞数目差别无统计學意义（P>0.05），提醒两种微载體高效扩增 ADSCs 的能力至关。见圖 4。
圖 4 两种微载體上细胞增殖曲线 *與 SF-PLLA 微载體比力P<0.05
2.2.4 qRT-PCR 检测 ① 成软骨基因表达：培育18 d，3 组均未检测到 COL2 及 COL10 基因表达。B组初期成软骨转录因子 SOX9，COL2 上级调控因子COMP 和成软骨成熟标记物 ACAN 基因相對于表达量均显著高于 A、C 组，差别有统计學意义（P< 0.05）；A、C 组間 COMP 基因相對于表达量比力差别有统计學意义（P<0.05），而 SOX9 和 ACAN 基因相對于表达量比力差别均无统计學意义（P>0.05）。见圖 5a～c。
②成骨基因表达：A、B、C 组間成骨转录因子RUNX2 基因相對于表达量比力差别无统计學意义（P>0.05）。A、B 组细胞成骨初期标记物 ONN、成熟标记物 OCN 基因相對于表达量均显著低于 C 组，差别有统计學意义（P<0.05）；B 组 OCN 基因相對于表达量显著高于 A 组（P<0.05），而 ONN 基因相對于表达量與 A 组比力差别无统计學意义（P>0.05）。见圖 5d～f。
③ 成脂基因表达：A 構成脂转录因子 PPARγ、成脂初期标识表记标帜物 LPL 及成熟脂肪标识表记标帜物 ADIPOQ基因相對于表达量均显著高于 B、C 组，差别有统计學意义（P<0.05）；B 组 PPARγ、ADIPOQ 基因相對于表达量显著低于 C 组（P<0.05），LPL 基因相對于表达量與 C 组比力差别无统计學意义（P>0.05）。见圖5g～i。
圖 5 培育 18 d qRT-PCR 检测各组 ADSCs 三系分解相干基因相對于表达量 *P<0.05 a. ACAN；b. SOX9；c. COMP；d. RUNX2；e. OCN；f. ONN；g. PPARγ；h. LPL；i. ADIPOQ
2.2.5 扩增所得 ADSCs 判定 ① 流式细胞術判定：B 组细胞 MSCs 阳性标识表记标帜物 CD90、CD105 表达较 C 组低落，但仍表示出阳性成果；而 A 组各标记物表达量與 C 组类似。见圖 6。A、B 组 MSCs 阴性标识表记标帜物 CD11b、CD1九、CD3四、CD4五、CD7三、 HLA-DR 與 C 组比拟未见较着扭转。② 三系引诱分解判定：3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂引诱21 d 後，阿利新蓝、茜素红及油红 O 染色均呈阳性，各组染色成果无较着差别。见圖 7。
圖 6 培育 18 d 3 组扩增所得 ADSCs 流式细胞術判定 蓝色為同型比照，赤色為样本；从上至下挨次為 A、B、C 组 a. CD90；b. CD3四、CD11b、CD1九、CD4五、HLA-DR；c. CD73；d. CD105
圖 7 3 组 ADSCs 成软骨、成骨、成脂引诱 21 d 後染色颠倒显微镜察看 从左至右挨次為 A、B、C 组 a. 阿利新蓝染色（×40）；b. 茜素红染色（×100）；c. 油红 O 染色（×100）
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讨 論
组织工程钻研及利用必要大量种仔细胞，大范围扩增 MSCs 并保持其干性對付组织工程的钻研具备首要意义。作為细胞培育载體，微载體為细胞扩增供给了大量细胞贴附面积與充沛的养分物資互换，是大范围扩增细胞的首選方案。此中，开辟合适细胞發展、贴附的微载體，是今朝钻研重點。此前，咱们報导了便宜多孔 PLLA 微载體利用于软骨细胞扩增，發明该微载體虽在保持软骨细胞表型上优于 CultiSpher G 微载體，但细胞黏附性欠安，致使细胞操纵率较低。為领會决這一问題，咱们選擇蚕丝中提取的 SF 對 PLLA 微载體举行润饰，制成 SF-PLLA 微载體，以改良 PLLA 微载體的生物相容性、機器强度及降解速度。SF-PLLA 微载體直径為 100～400 μm，與 CultiSpher G 微载體类似，合适细胞贴附增殖，并且二者均能降解，是杰出的组织工程钻研质料。
本钻研中，SF-PLLA 微载體可以很好地支撑细胞附着和增殖。该微载體呈多孔布局、孔隙率较大，為细胞大量增殖供给了有用空間，也有益于养分物資的互换。動态培育 18 d 時，该微载體仍能去口臭神器,连结不乱的形态布局，且细胞长入孔隙内部。质料降解方面，钻研表白CultiSpher G 微载體利用的明胶质料不乱性较差，卵白酶即能将其分化；而 SF-PLLA 质料具备相對于不乱的生物降解能力，體外降解時候约 1 年，能為细胞的大范围及持久培育供给加倍不乱的支架情况。
细胞增殖实行探讨了两种微载體扩增 ADSCs的效力，成果显示動态培育 18 d 後，两种微载體上的细胞都获得了高效扩增。但在最初 10 d 内， CultiSpher G 微载體上细胞扩增效力高于 SF-PLLA微载體，阐發是 CultiSpher G 微载體為明胶质料，细胞黏附性强，可率先到达快速增殖的细胞密度；但後期跟着 SF-PLLA 微载體上细胞逐步顺應情况後，两组细胞数目差距逐步缩小。培育 18 d 時，两种微载體上 ADSCs 均实現大量增殖，二者细胞总量差别无统计學意义。
在验證了 ADSCs 可在两种微载體上高效扩增後，下一步实行對扩增所得细胞举行 qRT-PCR 阐發，检测三系分解标记物相干基因表达环境，以肯定其三系分解能力是不是扭转。迄今為止，還没有针對MSCs 在 RCCS 微重力前提下培育收成落後行三系引诱分解能力阐發的钻研報导。本钻研成果表白， SF-PLLA 微载體扩增的细胞 SOX九、COMP、ACAN基因均上调，提醒 SF-PLLA 微载體扩增所得 ADSCs的成软骨能力增长，相较而言 CultiSpher G 微载體扩增细胞成软骨相干基因未见上调。這與微载體种类相干，丝素质料作為软骨组织工程杰出的利用质料，其理化機能可能促使其负载的 ADSCs 向软骨标的目的分解。其他學者也察看到在丝素质料上培养 MSCs 向软骨标的目的分解的征象，咱们钻研结論與之类似。别的，两组微载體上扩增所获细胞成骨相干基因表达未见较着上调，而成脂相干基因表达 SF-PLLA 组呈表达下调，CultiSpher G 组呈表达上调。但是，多項钻研表白，經過搅拌式培育的MSCs 成骨、成软骨能力增长，而成脂潜力被按捺。咱们的钻研成果與微载體搅拌式生物反响器培育的 MSCs 钻研结論分歧，其缘由尚不明白，多是因為咱们選用了 RCCS 體系，微重力前提下液體供给剪應力小于搅拌式培育，而高剪應力可經由過程影响毗连细胞骨架的整合素，發生响應生物化學旌旗灯号，扭转细胞内的 Ca2+ 浓度，从而启動成骨、成软骨分解。
最後，咱们按照國际细胞医治协會（ISCT）對MSCs 判定的举荐尺度，對微载體上所获细胞举行了 MSCs 判定。此中流式细胞術阐發成果显示，细胞概况标记物 CD90、CD105 均呈阳性， CD3四、CD11b、CD1九、CD4五、CD7三、HLA-DR 呈阴性，合适 MSCs 特性。三系分解引诱培育成果显示，阿利新蓝、茜素红、油红 O 染色均呈阳性，提醒该细胞仍具备三系分解能力。综合流式细胞術阐發及三系引诱分解成果，證明扩增所获细胞為ADSCs。
综上述，SF-PLLA 微载體扩增 ADSCs 能力與CultiSpher G 微载體至关，且成软骨分解能力上调，成脂能力降低，為後续软骨组织工程的支架质料摸索供给了钻研根本。但本钻研仅针對 ADSCs 在SF-PLLA 微载體上的扩增培育举行摸索，将来需對其他来历 MSCs 进一步钻研，以證实该类微载體在MSCs 培育的普适性。别的，SF-PLLA 微载體孔径仍较小，使细胞进入微载體内部贴附發展遭到阻碍，将来需對其布局举行改良。
参考文献：略
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